降溫程序是決定冷凍效果的另一個(gè)關(guān)鍵因素。若降溫速度過快，細(xì)胞內(nèi)部易形成冰晶對(duì)細(xì)胞造成損傷;若降溫速度過慢，會(huì)因細(xì)胞外部介質(zhì)的水分結(jié)冰而導(dǎo)致細(xì)胞過度脫水死亡。因?yàn)?60~0℃的低溫對(duì)細(xì)胞的損傷**，因此要選擇合適的降溫程序，讓細(xì)胞在能夠適應(yīng)溫度驟變的前提下，迅速安全地通過這個(gè)溫度危險(xiǎn)區(qū)，提高冷凍效果。根據(jù)研究的數(shù)據(jù)和相關(guān)報(bào)道，在精子超低溫冷凍前先于4℃平衡15~25min，再于距離液氮面15cm處停留5min，在距離液氮面5cm處停留10min，可使櫛江珧、近江牡蠣、馬氏珠母貝等精子冷凍效果達(dá)到**。樣品體積對(duì)冷凍效果也有影響。樣品體積的不同可能影響了熱的交換，體積小的樣品降溫快，體積大的樣品降溫慢，這間接造成了降溫條件的差異，導(dǎo)致精子活率不一樣。關(guān)于雙殼類最適冷凍體積的探討，朱豪磊認(rèn)為香港牡蠣在冷凍體積為0.75mL時(shí)復(fù)蘇效率最高;李純認(rèn)為紫貽貝、櫛孔扇貝和菲律賓蛤仔的最適精子冷凍體積分別為0.4、1和1mL。有研究的數(shù)據(jù)顯示，櫛江珧和近江牡蠣精子在冷凍體積為1.0~1.4mL的范圍內(nèi)保存效率最高。分析以上研究結(jié)果不同的原因，一方面是物種間的差異，更重要的是降溫程序存在差異。柯亞夫等認(rèn)為，不同體積的樣品保存時(shí)要對(duì)應(yīng)不同的降溫方法，以達(dá)到最適保存效果。所以，1.0~1.4mL的樣品體積最適合櫛江珧和近江牡蠣的研究結(jié)果，雙殼類精子的超低溫冷凍保存起始于20世紀(jì)70年代。
自增壓液氮罐
雙殼類精子相對(duì)于絕大多數(shù)脊椎動(dòng)物而言，體積小、細(xì)胞膜薄、細(xì)胞內(nèi)水分少，這些特點(diǎn)非常有利于精子的超低溫冷凍保存。研究的數(shù)據(jù)顯示近江牡蠣低溫冷凍后精子活率略高于櫛江珧，這暗示著近江牡蠣精子較櫛江珧精子的抗低溫能力較強(qiáng)，可能更適合于精子冷凍保存工作的開展。與此相比，卵子的冷凍保藏技術(shù)相對(duì)滯后，卵子中存在的大量水分，在冷凍時(shí)易形成胞內(nèi)冰晶而破壞細(xì)胞;卵內(nèi)構(gòu)成紡錘絲的微管對(duì)生化試劑非常敏感;超低溫冷凍易造成透明帶硬化或破裂，而形成多精受精，這些都是亟待解決的技術(shù)難題。精子和卵子超低溫保存技術(shù)相輔相成，方可有效地推動(dòng)種質(zhì)優(yōu)化和資源保護(hù)。
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