菌種是一個國家的重要自然資源 , 菌種保藏工 作是一項重要的微生物學基礎工作 , 菌種保藏工作者的任務是把從自然界分離得到的野生型或經人工 選育得到的用于科學研究和工業生產等方面的優菌種 、 菌株 ,用各種適宜的方法妥善保存 , 使之達到 不死 、 、 不衰 不變異 、 不污染 ,在長時間內保持原有的生產性狀和生命活力 ,以便于科學研究和生產使用 。
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1 微生物菌種保藏的基本原理
人們在長時間的工作實踐中 , 根據微生物的不 無論何種保藏方法 ,主要是根據微生物生理 、 生化特同要求 ,在菌種保藏工作中不斷摸索出各種方法 。
2保藏菌種用培養基
為了有效地保藏微生物菌種 , 首先需要有良好的培養基 。因此 , 研究選用適宜的培養基是微生物 菌種保藏最基本的工作 。例如 ,ATCC ( 美國的一個 微生物菌種保藏機構) 在 1970 年以前采用的培養基 有 498 種 ,1974 年有 724 種 ,1978 年達到 1006 種 ,平 均每年增加 60 多種 。
3 微生物菌種的保藏方法
將菌種接種在適宜的固體斜面培養基上 , 待菌 充分生長后 ,棉塞部分用油紙包扎好 , 移至 4 ～ 6 ℃ 的冰箱中保藏 。 保藏時間依微生物的種類而有不同 ,霉菌 、 放線 菌及有芽孢的細菌保存 2～4 個月 ,移種一次 。酵母 菌兩個月 ,細菌**每月移種一次 。斜面菌種應保 藏相繼三代培養物以便對照 , 防止因意外和污染造 成損失 。 此法的培養時間和培養溫度影響其保藏質量 。 培養時間過短 ,保存時容易死亡 , 培養時間長 , 生產 性能衰退 。一般以稍低于生長最適溫度培養至菌種 成熟進行保藏 ,效果較好 [6 ] 。 此法為實驗室和工廠菌種室常用的保藏法 , 優 點是操作簡單 ,使用方便 , 不需特殊設備 , 能隨時檢 查所保藏的菌株是否死亡 、 變異與污染雜菌等 。缺 點是容易變異 ,因為培養基的物理 、 化學特性不是嚴 格恒定的 ,屢次傳代會使微生物的代謝改變 ,而影響 微生物的性狀 ; 污染雜菌的機會亦較多 。
3. 2 液體石蠟保藏法 亦稱礦物油保藏法 , 定期移植保藏法的輔助方 法。 (1) 液體石蠟的準備 : 選用優質化學純液體石 蠟 ,將液體石蠟分裝加塞 , 用牛皮紙包好 , 采用以下 兩種方式進行滅菌 : ①121 ℃濕熱滅菌 30 min , 置 40 ℃ 恒溫箱中蒸發水分 , 經無菌檢查后備用 。 ② 160 ℃ 干熱滅菌 2 h ,冷卻后 ,經無菌檢查后備用 。 (2) 斜面培養物的制備 : 將需要保藏的菌種 , 在 最適宜的斜面培養基中培養 , 使得到健壯的菌體或 孢子 。 (3) 灌注石蠟 : 用滅菌吸管吸取滅菌的液體石 蠟 ,注入已長好菌的斜面上 ,其用量以高出斜面頂端1 cm 為準 ,使菌種與空氣隔絕 。 (4) 保藏 : 將試管直立 ,置低溫 ( 4～6 ℃ 干燥處 ) 或室溫下保存 ( 有的微生物在室溫下比冰箱中保存保藏 2 年以上不死 , 酵母菌可保藏 1 ～ 2 年 , 一般無 芽孢細菌也可保藏 1 年左右 , 甚至用一般方法很難 保藏的腦膜炎球菌 , 在 37 ℃ 溫箱內 , 亦可保藏 3 個 月之久 。此法的優點是制作簡單 ,不需特殊設備 ,且 不需經常移種 。缺點是保存時必須直立放置 , 所占 位置較大 ,同時也不便攜帶 。從液體石蠟下面取培 養物移種后 ,接種環在火焰上燒灼時 ,培養物容易與 殘留的液體石蠟一起飛濺 ,應特別注意 。 3.濾紙保藏法 (1) 將濾紙剪成 0. 5 cm × 2 cm 的小條 , 裝入 1.0. 6 cm × cm 的安瓿管中 ,每管 1～2 張 ,塞以棉塞 , 8 121 ℃ 滅菌 30 min 。 ( 2) 需要保存的菌種 ,在適宜的斜面培養基上培養 ,使充分生長 。 ( 3) 滅菌脫脂牛乳 1 ～ 2 mL 滴加在滅菌培養皿 或試管內 ,取數環菌苔在牛乳內混勻 ,制成濃懸液 。 (4) 用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液 內 ,使其吸飽 ,再放回至安瓿管中 ,塞上棉塞 。 (5) 將安瓿管放入內有五氧化二磷作吸水劑的 干燥器中 ,用真空泵抽氣至干 。 (6) 將棉花塞入管內 , 用火焰熔封管口 , 保存于 低溫下 。 (7) 需要使用菌種 , 復活培養時 , 可將安瓿管口 在火焰上燒熱 ,滴一滴冷水在燒熱的部位 ,使玻璃破 裂 ,再用鑷子敲掉口端的玻璃 , 待安瓿管開啟后 , 取 出濾紙 ,放入液體培養基內 ,置溫箱中培養 。 細菌 、 酵母菌 、 絲狀真菌均可用此法保藏 , 前兩 者可保藏 2 年左右 , 有些絲狀真菌甚至可保藏 14 ～ 17 年之久 。此法較液氮 、 冷凍干燥法簡便 , 不需要 特殊設備 。
沙土保藏法 (1) 取河沙加入 10 %稀鹽酸 , 加熱煮沸 30 min ,以去除其中的有機質 。 ( 2) 倒去酸水 ,用自來水沖洗至中性 。 (3) 烘干 ,用 40 目篩子過篩 , 以去掉粗顆粒 , 備 用(4) 另取非耕作層的不含腐植質的瘦黃土或紅的時間還要長 ) 。保藏時間 2 ～ 10 年 。保藏期間應 定期檢查 ,如培養基露出液面 ,應及時補充無菌的液 體石蠟 。 (5) 恢復培養 : 恢復培養時 , 挑取少量菌體轉接 在適宜的新鮮培養基上 ,生長繁殖后 ,再重新轉接一 次。 此法實用而效果好 。霉菌 、 放線菌 、 芽孢細菌可土 ,加自來水浸泡洗滌數次 ,直至中性 。 (5) 烘干 ,碾碎 ,通過 100 目篩子過篩 , 以去除粗 顆粒 。 (6) 按一份黃土 、 三份沙的比例 ( 或根據需要而 用其他比例 , 甚至可全部用沙或全部用土 ) 摻合均 勻 ,裝入 10 mm × mm 的小試管或安瓿管中 ,每管 100 裝 1 g 左右 ,塞上棉塞 ,121 ℃ 濕熱滅菌 30 min ,烘干。 ( 7) 進行無菌檢查 ,每 10 支沙土管抽一支 ,將沙土倒入肉湯培養基中 ,37 ℃ 培養 48 h ,若仍有雜菌 , 則需全部重新滅菌 , 再作無菌試驗 , 直至證明無菌 , 方可備用 。 (8) 選擇培養成熟的 ( 一般指孢子層生長豐滿 的 ,營養細胞用此法效果不好 ) 優良菌種 , 以無菌水 洗下 ,制成孢子懸液 。 (9) 每支沙土管中加入約 0. 5 mL ( 一般以剛剛 使沙土潤濕為宜) 孢子懸液 ,以接種針拌勻 。 ( 10) 放入真空干燥器內 ,用真空泵抽干水分 ,抽 干時間越短越好 ,務使在 12 h 內抽干 。 (11) 每 10 支抽取一支 , 用接種環取出少數沙 粒 ,接種于斜面培養基上 , 進行培養 , 觀察生長情況 和有無雜菌生長 , 如出現雜菌或菌落數很少或根本 不長 ,則說明制作的沙土管有問題 ,尚須進一步抽樣 檢查 。 ( 12) 若經檢查沒有問題 ,用火焰熔封管口 ,放冰 箱或室內干燥處保存 。每半年檢查一次活力和雜菌 情況 。 ( 13) 需要使用菌種 ,復活培養時 ,取沙土少許移 入液體培養基內 ,置溫箱中培養 。 此法多用于能產生孢子的微生物如霉菌 、 放線 菌 ,因此在抗生素工業生產中應用最廣 , 效果亦好 , 可保存 2 年左右 ,但應用于營養細胞效果不佳 。
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以上各法可根據實驗室具體條件與需要選用 , **是每株菌種都采用兩種以上的保藏方法 , 并根 據保藏菌種的保質期 ,每隔一定時間 ,進行入藏菌種 的復活檢驗和更新
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